中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
SN/T 5760.3—2024
進(jìn)出口化妝品中病原菌檢測(cè)方法
微滴式數(shù)字PCR 法
第3 部分：銅綠假單胞菌
Droplet digital PCR method for detection of pathogens in cosmetics for
import and export—
Part 3: Pseudomonas aeruginosa
ICS 71.100.70
CCS Y 42
中華人民共和國(guó)海關(guān)總署發(fā) 布
2024-12-16 發(fā)布2025-06- 01 實(shí)施
I
前 言
本文件按照GB/T 1.1— 2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1 部分: 標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定
起草。
本文件為SN/T 5760— 2024《進(jìn)出口化妝品中病原菌檢測(cè)方法 微滴式數(shù)字PCR 法》的第3 部分。
SN/T 5760— 2024 已經(jīng)發(fā)布了以下部分：
——第1 部分：大腸埃希氏菌；
——第2 部分：金黃色葡萄球菌；
——第3 部分：銅綠假單胞菌；
——第4 部分：肺炎克雷伯氏菌；
——第5 部分：洋蔥伯克霍爾德菌；
——第6 部分：沙門氏菌；
——第7 部分：白色念珠菌；
——第8 部分：破傷風(fēng)梭菌；
——第9 部分：檸檬酸桿菌；
——第10 部分：嗜麥芽窄食單胞菌。
請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。
本文件由中華人民共和國(guó)海關(guān)總署提出并歸口。
本文件起草單位：中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心、深圳海關(guān)食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、北京林電偉
業(yè)電子技術(shù)有限公司、北京市農(nóng)林科學(xué)院、北京電子科技職業(yè)學(xué)院、北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院（北
京市醫(yī)用生物防護(hù)裝備檢驗(yàn)研究中心）、中國(guó)食品藥品檢定研究院、北京新羿生物科技有限公司。
本文件主要起草人：王藝凱、趙芳、邱燁、祝天宇、賈文珅、王紅、李達(dá)、鄒迎曙、黃杰、劉
東來(lái)、芮孝、王勝利。
III
引 言
化妝品中病原菌可通過(guò)不同途徑進(jìn)入機(jī)體，對(duì)消費(fèi)者的健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。SN/T 5760—2024《進(jìn)出
口化妝品中病原菌檢測(cè)方法 微滴式數(shù)字PCR 法》采用微滴式數(shù)字PCR 法，對(duì)化妝品中10 種代表性
病原菌進(jìn)行檢測(cè)，旨在建立靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)的檢測(cè)方法，以保護(hù)消費(fèi)者健康，促進(jìn)化妝品進(jìn)
出口貿(mào)易。SN/T 5760— 2024 由10 個(gè)部分組成：
——第1 部分：大腸埃希氏菌；
——第2 部分：金黃色葡萄球菌；
——第3 部分：銅綠假單胞菌；
——第4 部分：肺炎克雷伯氏菌；
——第5 部分：洋蔥伯克霍爾德菌；
——第6 部分：沙門氏菌；
——第7 部分：白色念珠菌；
——第8 部分：破傷風(fēng)梭菌；
——第9 部分：檸檬酸桿菌；
——第10 部分：嗜麥芽窄食單胞菌。
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進(jìn)出口化妝品中病原菌檢測(cè)方法 微滴式數(shù)字PCR 法
第3 部分：銅綠假單胞菌
1 范圍
本文件描述了進(jìn)出口化妝品中銅綠假單胞菌的微滴式數(shù)字PCR 檢測(cè)方法。
本文件適用于進(jìn)出口化妝品中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)。
本文件所能達(dá)到的檢出限（LOD50）為0.50 CFU/g（mL）~1.37 CFU/g（mL）。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文
件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單) 適
用于本文件。
GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
GB 19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求
GB/T 27403 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測(cè)
SN/T 5075 化妝品微生物檢驗(yàn)制樣規(guī)范
化妝品安全技術(shù)規(guī)范
3 術(shù)語(yǔ)和定義
本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。
4 縮略語(yǔ)
下列縮略語(yǔ)適用于本文件。
DNA ：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）
ddPCR ：微滴式數(shù)字PCR（droplet digital Polymerase Chain Reaction）
PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ Polymerase Chain Reaction）
16S rRNA ：16S 核糖體RNA（16S ribosomal RNA）
5 方法原理
針對(duì)銅綠假單胞菌16S rRNA 編碼基因的保守序列設(shè)計(jì)引物、探針，將一定濃度的引物、探針與
模板DNA 及數(shù)字PCR 反應(yīng)預(yù)混液混合，配成PCR 反應(yīng)體系。將該數(shù)字PCR 體系分布到12 000 個(gè)
~20 000 個(gè)微滴中，使大部分微滴中模板DNA 分子的數(shù)量為1 或0，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。16S rRNA
探針5’端標(biāo)記VIC 熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記BHQ1。利用數(shù)字PCR 系統(tǒng)的檢測(cè)通道，可對(duì)每個(gè)微滴的
熒光信號(hào)進(jìn)行采集分析。含有模板DNA 的微滴出現(xiàn)熒光信號(hào)的增強(qiáng)，形成陽(yáng)性微滴簇。最終根據(jù)陽(yáng)
2
性微滴的有無(wú)判定樣品中是否含有銅綠假單胞菌。
6 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
6.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ ± 1 ℃。
6.2 冰箱：2 ℃ ~8 ℃、-20 ℃。
6.3 均質(zhì)器或乳液分散機(jī)（轉(zhuǎn)速1 000 r/min 以上）。
6.4 電子天平：感量0.1 g。
6.5 高速微量離心機(jī)（最大離心力不小于 10 000 g）。
6.6 渦旋振蕩儀。
6.7 加熱裝置：95 ℃ ~100 ℃。
6.8 核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。
6.9 無(wú)菌均質(zhì)袋或均質(zhì)杯。
6.10 生物安全柜。
6.11 ddPCR 擴(kuò)增儀及相關(guān)配套設(shè)備。
6.12 移液器及配套吸頭：100 μL~1 000 μL、20 μL ~200 μL、10 μL ~100 μL、0.5 μL ~10 μL。
6.13 離心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL。
6.14 陽(yáng)性對(duì)照：銅綠假單胞菌 ATCC 27853 或等效菌株或含目的片段的DNA。
7 材料與試劑
7.1 僅使用分析純?cè)噭┖头螱B/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑均用無(wú)DNA 酶污染的容器分裝。
7.2 DNA 提取液：見(jiàn)附錄A 中A.1。
7.3 大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80（SCDLP）液體培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A 中A.2。
7.4 細(xì)菌基因組提取試劑盒。
7.5 生理鹽水：見(jiàn)附錄A 中A.3。
7.6 ddPCR 反應(yīng)配套試劑。
7.7 銅綠假單胞菌16S rRNA 編碼基因特異性序列片段參見(jiàn)附錄B，引物探針序列如下：
Primer-F ：5’-CGAGCGCAACCCTTGTCCTTA-3’
Primer-R ：5’-CGTCATCCCCACCTTCCTCCG-3’
Probe-P ：5’-VIC-TTACCAGCACCTCGGGTGGGC-BHQ1-3’
8 檢驗(yàn)程序
進(jìn)出口化妝品中銅綠假單胞菌ddPCR 檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。
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圖1 進(jìn)出口化妝品中銅綠假單胞菌檢驗(yàn)程序
9 實(shí)驗(yàn)操作步驟
9.1 樣品前處理
待測(cè)的樣品應(yīng)在室溫下保存，不要溫育、冷藏和冷凍樣品。樣品的制樣處理參照SN/T 5075 的規(guī)
定執(zhí)行。
9.2 增菌培養(yǎng)
吸取10 mL 1:10 樣品稀釋液接種到 90 mL SCDLP 增菌液中，置于36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)
18 h~24 h。
9.3 DNA 提取
混勻增菌培養(yǎng)物，在其液面表層吸取1mL，于 10 000 g~12 000 g 離心3 min，棄去上清液。必要時(shí)，
用生理鹽水清洗沉淀1 次~2 次。用1mL 生理鹽水混懸沉淀，于10 000 g~12 000 g 離心3 min，棄去
上清液。在沉淀中加入 50 μL DNA 提取液振蕩混勻，于95 ℃ ~100 ℃加熱 10 min，室溫冷卻2 min 后，
于10 000 g~12 000 g 離心5min，取上清液作為 DNA 模板。若不能及時(shí)分析，DNA 模板可置于-20 ℃
以下冷凍保存?zhèn)溆谩?br />
注: 若采用商品化 DNA 提取試劑盒，按其操作說(shuō)明制備 DNA 模板。
9.4 DNA 濃度和純度測(cè)定
樣品DNA 使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm 和280 nm 處的吸收值A(chǔ)260 和A280，
4
按照公式（1）計(jì)算DNA 的濃度。
ρ=A260×N×50 ……………………………（1）
式中：
ρ —— DNA 濃度，單位為納克每微升（ng /μL）；
A260 —— 260 nm 處的吸光值；
N —— 核酸稀釋倍數(shù)。
A260/A280 在1.8 ~ 2.0 之間，DNA 濃度為0.01 ng/ μL~10 ng/ μL 時(shí)，適用 ddPCR 檢測(cè)。
9.5 ddPCR 檢測(cè)
9.5.1 對(duì)照和平行
檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 或含目的
片段的DNA 作為陽(yáng)性對(duì)照，以非銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 作為陰性對(duì)照，用等體積的一級(jí)水代替
模板DNA 作為空白對(duì)照。每個(gè)待檢樣品提取的DNA 溶液進(jìn)行3 個(gè)平行ddPCR 檢測(cè)。
9.5.2 反應(yīng)體系
按照表1 配制ddPCR 反應(yīng)體系。1）
表1 ddPCR 反應(yīng)體系
試劑名稱儲(chǔ)備液濃度終濃度
體積
μL
反應(yīng)預(yù)混液4× 1× 7.5
Primer-F 10 μmol/L 0.6 μmol/L 1.8
Primer-R 10 μmol/L 0.6 μmol/L 1.8
Probe-P 10 μmol/L 0.3 μmol/L 0.9
DNA 模板— — 2.0
水— — 16 .0
體系總體積— — 30 .0
9.5.3 微滴生成
將配制好的ddPCR 反應(yīng)混合液，加入微滴生成裝置加樣孔中，按儀器操作說(shuō)明生成微滴。
9.5.4 ddPCR 擴(kuò)增
將生成的微滴八連管加蓋后，緩慢轉(zhuǎn)移至PCR 儀上，按以下參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95 ℃ 30 s ；94
℃ 10 s，57 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；12 ℃ 10 min。升降溫速度設(shè)置為 ≤ 2 ℃ /s。
注：ddPCR 反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號(hào)的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
9.5.5 熒光信號(hào)讀取
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將多孔板放入ddPCR 檢測(cè)儀中對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行熒光檢測(cè)，采用FAM 通道讀取
熒光信號(hào)。
1）非商業(yè)性聲明：本文件給出的反應(yīng)體系是使用伯樂(lè)設(shè)備完成的。給出這一信息是為了方便本文件使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品
的認(rèn)可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可使用這些等效產(chǎn)品。
5
10 結(jié)果分析與表述
10.1 值的設(shè)定
根據(jù)空白對(duì)照的終點(diǎn)熒光值設(shè)定閾值限，閾值限應(yīng)對(duì)空白和陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行明確的區(qū)分。
10.2 質(zhì)量控制
10.2.1 體系分隔產(chǎn)生的有效微滴的總數(shù)量滿足所用ddPCR 儀器型號(hào)要求。
10.2.2 陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)熒光信號(hào)檢出。
10.2.3 陽(yáng)性對(duì)照有熒光信號(hào)檢出且陰性微滴簇與陽(yáng)性微滴簇能夠截然分開。
10.2.4 以上質(zhì)控條件有一項(xiàng)不符合者，實(shí)驗(yàn)結(jié)果視為無(wú)效，查找原因后再次進(jìn)行ddPCR 檢測(cè)。
10.3 結(jié)果表述
10.3.1 待檢樣品所有微滴的熒光信號(hào)均低于閾值限，待測(cè)樣品中不含有銅綠假單胞，檢測(cè)結(jié)果表述
為“每克或毫升未檢出銅綠假單胞菌”。
10.3.2 待檢樣品3 個(gè)平行樣品中至少1 個(gè)平行樣品有熒光信號(hào)高于閾值限的陽(yáng)性微滴，且陰性微滴
簇與陽(yáng)性微滴簇能夠截然分開，該樣品結(jié)果為銅綠假單胞菌初篩陽(yáng)性，對(duì)樣品的增菌液進(jìn)一步按《化
妝品安全技術(shù)規(guī)范》中的操作步驟進(jìn)行確認(rèn)后報(bào)告結(jié)果。
11 生物安全和防污染措施
為保護(hù)實(shí)驗(yàn)室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員進(jìn)行檢測(cè)，所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)按照 GB
19489 中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
防止交叉污染的措施應(yīng)按照 GB/T 27403 中的規(guī)定執(zhí)行。
6
附 錄 A
（規(guī)范性）
主要培養(yǎng)基和試劑
A.1 DNA 提取液
A.1.1 成分
Chelex-100 5.0 g
滅菌一級(jí)水 100 mL
A.1.2 制法
將 Chelex-100 顆粒加入滅菌一級(jí)水中混勻，2℃ ~8℃保存。
A.2 大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80（SCDLP）液體培養(yǎng)基
A.2.1 成分
酪蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鉀 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
卵磷脂 1.0 g
吐溫80 7.0 g
蒸餾水 1 000 mL
A.2.2 制法
先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調(diào) pH 值為 7.2~7.3，分
裝，每瓶90 mL，121 ℃高壓滅菌 20 min。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80 充分混合，冷卻至 25
℃左右使用。
注：如無(wú)酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
A.3 生理鹽水
A.3.1 成分
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1 000 mL
A.3.2 制法
將氯化鈉在蒸餾水中溶解，121 ℃高壓滅菌15 min。
7
附 錄 B
（資料性）
銅綠假單胞菌特異性基因序列片段
銅綠假單胞菌16S rRNA 基因序列（部分）及引物設(shè)計(jì)示意圖（GenBank No.NR_026078.1）見(jiàn)圖 B.1。
AAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGA
GAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACAGAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCG
TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTG
GGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCT
TACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGTGGGAGCTAA
TCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGG
注：陰影部分分別為上下游引物序列，方框部分為探針序列。
圖 B.1 銅綠假單胞菌16S rRNA 基因序列（部分）及引物設(shè)計(jì)示意圖
